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本制品是Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶，这种混合酶可以染色体和其它细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应。在人的染色体上可以扩增长度可达27kb的DNA片段，而以λDNA为模板则可以扩增出高达40kb的片段。

一般PCR法具有一定的局限性，特别是难以扩增5kb以上的长链DNA，这严重限制了PCR法的推广和应用。通过改变PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer、PCR扩增条件等，使长链DNA的扩增成为可能，为此，我公司研发推出了本制品。

一般用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、DNA平未端加A等，产物可直接用于TA克隆。

• 10×Long Taq Buffer的pH值较高，可能会形成[Mg(OH)2]沉淀，使用前要充分溶解，并Votex保证可能的沉淀重新溶解，或者37℃温育5分钟，然后Votex充分混匀。
  
• 扩增长片段强烈推荐使用0.2μL薄壁管。其他试管未经测试。较厚的试管在92℃时不能有效地使模板变性。变性时，尽可能缩短变性时间，降低变性温度。第一步变性在92～94℃下进行2分钟（GC含量高可延长时间达5分钟）。在循环过程中尽可能缩短变性时间（92～94℃下进行10～15秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌呤和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时，应该尽可能的降低变性温度和时间。变性需要的时间在不同的PCR仪器上稍有不同。
  
• 如果扩增模板GC含量高或者扩增片段比较长，可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%～8%，最常用2%（<30kb）或者4%（>30kb）往往会改善扩增效果。
  
• 扩增长片段，引物一般终浓度为0.3～1μM，长度最好为27～36bp；退火温度一般在65℃～70℃，此时退火温度和延伸温度基本一致，可将退火延伸在同一个温度进行，使用2阶段扩增法。当然如果设计的引物在20bp左右，则还是使用传统3阶段扩增法为好。
  
• 模板一般使用0.1～2.5ng（λphage）或者0.1～1μg(Human)
  
• 10×Long Taq Buffer中镁离子浓度为2.5mM，建议dNTP终浓度为400μM，然而要得到最佳结果，优化Mg²⁺的浓度是必需的。如果含有较高EDTA或者螯合剂，则应该提高Mg²⁺；如果要增加dNTP浓度，相应也要增加Mg²⁺浓度。

• 配制反应体系：
  

  成分	用量
  Long-Taq DNA Polymerase(5U/μL)	0.5～1μL
  10×Long PCR Buffer	5μL
  dNTP Mixture（各2.5mM）	8μL
  噬菌体DNA或人基因组DNA	0.1～5ng或0.1～1μg
  引物1（20μM）	0.5～1μL
  引物2（20μM）	0.5～1μL
  灭菌纯水	至50μL

• 建议循环条件：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	1～2分钟	1
  变性	94℃	10～20秒	10
  退火	65℃(视引物而定)	30秒
  延伸	68℃	45～60秒/kb
  变性	94℃	10～20秒	15～20
  退火	65℃(视引物而定)	30秒
  延伸	68℃	45～60秒/kb+1～20秒“自动延长”/循环
  最后延伸	68℃	10分钟	1

  • 扩增大片段尤其是20kb以上的片段我们建议15-30循环时每个循环的延伸时间要增加10～15秒“自动延长”时间，如果PCR仪器没有“自动延长”功能，那么设定延伸时间时候建议在原有基础上面增加1～4分钟。
    

    PCR片段长度(kb)	延伸时间(分钟)	自动延长/循环(秒)
    3	2	1
    6	4	2
    10	7	5
    15	10	5
    20	14	10
    25	17	10
    30	20	15
    35	24	15
    40	27	20
    45	30	20